2020.8.28丨转录组、全转录组产品概述和应用方向

• 知识点梳理
  • 转录调控是基因表达调控的一种重要方式
    • 转录水平调控
    • 翻译水平调控
    • 翻译后水平调控
  • 转录调控测序研究热点

    

  • RNA分类

    

  • 转录组研究
    • 概念
      • 转录组（transcriptome）：
        • 特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合，包括 mRNA和ncRNA，从整体水平研究基因功能和基因结构，揭示特定生物学过程的分子机理。
      • 转录组测序（RNA-seq）：
        • 通过第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织 在某一状态下的几乎所有转录本。
      • 一般转录组测序指对mRNA反转录cDNA进行转录组测序分析。
      • 可分析转录本的结构和表达，发现未知转录本，识别可变剪切位点和SNA等。
      • 适用于生长发育、环境适应、免疫互作、野生突变表型、分子标记开发等。
  • miRNA研究
    • 定义
      • MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24nt的小 RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，参与许多生命过程，如细 胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等。
    • 特点
      • 表达具有组织特异性和阶段特异性。
      • 具有高度保守性，即能在其他物种中找到同源体。
      • 具有独有的序列特征，如5’端第一个碱基对U有强烈倾向性。
      • 一个miRNA可调控多个基因表达，几个miRNAs也可共同调控某个基 因的表达。
    • 作用机制
      • （1）翻译抑制
        • miRNA与靶mRNA通过6-7个碱基互补结合，可导致miRNA在蛋白质翻 译水平上抑制靶基因表达（哺乳动物中比较普遍）。
      • （2）mRNA的降解 （最广泛的功能）
        • miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。如果miRNA与靶位点完全互补 （或者几乎完全互补），那么这些miRNA的结合往往会引起靶mRNA 的降解(在植物中比较常见)。
      • （3）转录调控
        • 表观遗传是指在核酸序列水平上不涉及基因组改变的遗传变化。最近研 究发现表明， miRNA影响基因启动子的CpG岛甲基化作用，在转录水 平直接对靶基因进行调控作用。
      • （4）其他机制
        • （1）miRNA的前体pri-miRNA可翻译为多肽；
        • （2）miRNA可与其他功能蛋白相结合；
        • （3）miRNA可直接**TLR受体蛋白（非改变表达 量）；
        • （4）miRNA可提高蛋白表达水平；
        • （5）miRNA靶向调控线粒体相关基因mRNA；
        • （6）miRNA可直接**基因转录过程；
        • （7）miRNA可靶向负调控其他非编码RNA的前体 RNA。
    • 应用方向
      • 适用范围广：大部分miRNA来源于基因间区，适用于有参 考基因组或转录组信息的物种。
      • 适用研究方向全面：所有适用于转录组研究的生物学性状， 如发育调控、环境适应、免疫互作。
      • 产品类型：根据小RNA的不同特征可分为3类： 动植物miRNA鉴定分析 病毒siRNA分析 动植物siRNA鉴定分析：piRNA，NatRNA，phasiRNA （所有piRNA只能应用于动物生殖组织中，植物不能做）
      • 联合分析：可以与任何转录调控产品进行联合分析。
        • 转录组+小RNA
        • lncRNA+小RNA
        • circRNA+小RNA+lncRNA
        • 甲基化+mRNA+小RNA
  • LncRNA研究
    • 定义
      • 长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200nt的非编码RNA，其在转录 沉默、转录**、染色体修饰、核内运输等均具有重要的功能。
    • 特点
      • 1、lncRNA的长度在200-100000nt之间，具有mRNA相似的结构，经剪 接，具有ployA尾巴以及启动子结构，分化过程中有动态的表达以及不 同的剪接方式，形成不同的lncRNA；
      • 2、lncRNA一般无蛋白编码能力，但是有很多lncRNA能编码一些短肽；
      • 3、lncRNA的保守性较低；
      • 4、lncRNA的表达具有组织特异性以及时空特性。不同的组织表达 lncRNA的量是不同的，即使是同一组织中，处于不同状态时表达量也 不同；
      • 5、lncRNA的定位有区别。不同的lncRNA在细胞内（外）的丰度不同。
    • 作用机制
      • DNA水平：
        • 1、在基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；
        • 2、抑制RNA聚合酶II或介导染色质重构、组蛋白修饰，影 响下游基因的表达；
      • RNA水平：
        • 3、与基因转录本形成互补双链，影响翻译，剪切， mRNA的稳定性(类似miRNA功能)；
        • 4、与转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源 性siRNA；
        • 8、作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子；
        • 9、lncRNA起到miRNA海绵作用，调控靶基因表达；
      • 蛋白水平：
        • 5、与特定蛋白质结合，调节相应蛋白的活性；
        • 6、作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；
        • 7、结合到特定蛋白质上，改变蛋白质的细胞定位。
      • 作用机制图

        

    • 应用方向
      • 适用物种：有参考基因组的真核生物

        

  • circRNA研究
    • 定义
      • 环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，呈封闭环状结构，对核酸酶不敏感，比线性RNA更稳定，不易降解，这使得环状 RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。
      • circRNA主要是由外显子环化而成，而有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构（lariat）
      • circRNA主要来自编码基因的外显子，也可能来自编码基因的内含子、基因间区、UTR区域或非编码RNA基因位点
    • 特点
      • circRNA无PolyA的尾巴 常规线性的RNA有一些多聚A的尾巴，而circRNA是闭合的环状RNA，其大 部分均是由外显子构成的，所以并无多聚A的尾巴。
      • circRNA的细胞定位、丰度 绝大多数circRNA在细胞浆中富集，其丰度有时甚至比相应的线性mRNA高 10余倍。
      • circRNA的稳定性：闭合的环状结构使其不易被核酸酶降解。
      • circRNA具有细胞与组织特异性，不同物种间进化保守性很强。
      • 极少数circRNA翻译为蛋白。
      • circRNA作为内源性竞争RNA (ceRNA)
        • 多数具有miRNA应答元件，能与miRNA相互作用，从而调控靶基因的表达 。
    • 作用机制
      • 这张图说的是circRNA的已知功能，可以有多种研究方向，这些都可以作为很好的科研故事，有的在 胞核内，有的来自于胞质中的机制，有的作为分泌物标记marker。
      • 细胞核：
        • 1.假设转录本的表达量是一定的，circRNA的形成本身影响了其他同源转录本的结果；
        • 2.circRNA会滞留在细胞核内，结合核小核糖核酸蛋白，调控某些基因的转录；
        • 3.circRNA滞留在核内一定数量后，直接阻断母本DNA的其他转录本的转录，也可以 称之为“负反馈回路调控”。
      • 细胞质：
        • 4.circRNA机制作为海绵吸附miRNA，正向调控下游靶基因的表达水平；
        • 5.circRNA在胞质内吸附蛋白质形成circRNPs行使功能；
        • 6.胞质中的circRNA参与翻译成多肽；
        • 7.circRNA行使假基因的功能，具有调控基因表达的潜能。
      • 细胞外：
        • 8.分泌到血液、唾液等体液中作为疾病预测的biomarker，另外它在某些细胞分泌的 外泌体中大量存在，起到了细胞与细胞之间的频繁对话，也是一个研究非常火热的 领域。
    • 测序策略
      • 两种建库方式

        

  • ceRNA
    • 2011年，Pandolfi等人提出了一种关于mRNAs、 Pseudogenes，lncRNAs如何相互“交流”的新假说---- ceRNA（competing endogenous RNA，竞争性内源 RNA）的假说，一种RNA间相互作用的新机制，是指所 有类型的RNA都可以通过microRNA应答元件（MREs, microRNA response elements）进行相互作用认为通过 这种ceRNA能形成一种大规模转录调控网络，可以扩大 人类基因组中的功能性遗传信息。
    • 团结在以miRNA为核心的RNA调控网络周围

      

  • 全转录组研究
    • 定义
      • 全转录组是指细胞所能转录出来的所有类 型RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA （non-coding RNA，ncRNA）。
      • 目前针对非编码RNA的研究主要集中在 small RNA，lncRNA和circRNA。对特定 细胞的特定状态下全转录组的研究，可以 从RNA层面系统地揭示生物学背后的转录 调控规律。
    • 研究意义
      • 转录组学是分子生物学研究的重要组成部分，随着科研的深入，获取特定组织或细胞在特定状态下所有转录本 （mRNA和非编RNA）信息的总和，已成为科研工作者最新的迫切需求：与单一的mRNA或ncRNA研究相比，全转 录组主要存在以下优势。
      • 单一组学技术不能全景地揭示生命活动的本质规律;
      • 全转录组为较新的概念和产品，在转录组基础上加入了非编码RNA的研究 内容，本身是一定的热点研究，有助于提高文章发表档次，且全转录组的 研究对实验材料的限制更少。
      • 全转录组测序技术不仅可同时检测mRNA、lncRNA、circRNA、 microRNA，而且可结合多种RNA信息进行ceRNA整合分析，探究其潜 在的调控网络机制，已成为解释生物学现象的研究利器。
      • 可以进行两两间关联分析和两者以上ceRNA网络调控分析，有助于缩小 筛选范围，挖掘关键基因。
      • 一方面节省了样本量，另一方面使用同一批次样本提高了研究结果可比性。
      • 项目性价比高，不需要太多分子实验；
    • 适用范围
      • 物种
        • 有参考基因组物种；
        • 普通二代转录组研究较多，基因功能较清楚。
        • 研究非编码RNA与基因的转录调控关系。
      • 项目
        • 经费相对充足；
        • 有二代转录组研究基础或一定了解；
        • 关注调控类非编码RNA（miRNA、lncRNA、circRNA）及其与功能 基因的调控关系；
        • 希望发表高分（5分以上）文章；
        • 高性价比，mRNA-miRNA-lncRNA-circRNA，可两两联合发表2篇以上文章。
    • 研究策略
      • 适用情况
        • 生长发育
        • 环境使用
        • 免疫互作
        • 突变表型
      • 建库测序
        • 1+2 = 4

          

      • 联合分析
        • 联合策略

          

          
          circRNA好像写错了
• 个人总结
  • 转录调控六大产品
    • 甲基化
    • miRNA
    • 转录组测序（二代）
    • 全长转录组（三代）
    • lncRNA测序（全转录组）
    • circRNA测序（全转录组）
  • 转录组默认为mRNA测序
  • lncRNA测序内部包含mRNA建库数据
  • miRNA最广泛的功能为：靶向负调控基因的mRNA水 平，介导其降解。
  • ceRNA不是RNA，是一种作用机制。
  • 全转录组 = 4种产品（mRNA+miRNA+lncRNA+circRNA）